Det finns olika metoder för resistensbestämning. Antingen används dilutionsmetoder (spädningsmetoder) eller diffusionsmetoder. Oavsett vilken metod man väljer är det mycket viktigt att beprövade riktlinjer följs och att den är kvalitetssäkrad.
Dilutionsmetoder
Dilutionsmetoder (spädningsmetoder), är kvantitativa och ger direkt ett värde på hur känslig bakterien är för olika antibiotika. Metoden innebär att man odlar bakterien i olika koncentrationer av antibiotika, antingen på agar eller i buljong. Efter inkubering avläses resultatet som den lägsta koncentrationen av ett visst antibiotikum som krävs för att hämma bakterieväxt (Minimum Inhibitory Concentration, MIC). Vid SVA och många andra veterinärmedicinska laboratorier i landet används en spädningsmetod i mikroskala, så kallad mikrodilution.
Katjonjustering av MuellerHinton-buljong
Det är viktigt att man har rätt mängd kalcium (Ca++) och magnesium (Mg++) i MuellerHintonbuljongen när man gör resistensbestämningar med mikrodilution. Om inte så kan MIC bli fel och vissa antibiotika är mer känsliga, till exempel aminoglykosider som gentamicin. Det ska vara 20-25 mg Ca++/liter färdig buljong och 10-12,5 mg Mg++/liter färdig buljong. Om innehållet av kalcium och magnesiumjoner är för lågt, ska detta justeras till rätt nivå med en stamlösning. Hur mycket katjoner pulvret till buljongen innehåller brukar stå på analyscertifikatet till den batch man har köpt. Det går också att köpa buljongpulver som redan har justerat innehåll av kalcium och magnesium ”cation-adjusted” och då behöver man inte sätta till någon stamlösning.
Pseudomonas aeruginosa CCUG 17619 (ATCC 27853) är känslig för divalenta katjoner och kan användas för test av buljongen. För låga halter av katjonerna ger för lågt MIC av aminoglykosider. Tetracyklin påverkas också av katjoninnehållet i mediet.
Tymidininnehåll i MuellerHinton-buljong
När trimetoprim och sulfonamider ska testas tillsätts 0,2 IU/ml tymidinfosforylas om inte mediet har känd låg halt eller har testats för tymidininnehåll.
För att testa används Enterococcus faecalis ATCC 33186, som är särskilt känslig för tymidin. Förhöjda halter tymidin medför svårigheter att avläsa MIC för trimetoprim-sulfa. MIC för T/S ≤ 0,5/9,5 mg/L för kontrollstammen innebär att buljongen är säker att använda.
Diffusionsmetoder
Diffusionsmetoder är kvalitativa (diskdiffusion) eller semikvantitativa (gradientremsor). Bakteriestammen som ska testas med diskdiffusion stryks ut på en speciell agarplatta och filterlappar med en bestämd koncentration antibiotika läggs på plattan. Antibiotika kommer då att diffundera ut i mediet och resultatet avläses efter inkubering som diametern på den hämningszon, inom vilken det inte växer några kolonier, som finns runt lappen. Genom extrapolering från standardkurvor (regressionslinjer mellan zondiameter och MIC för olika testade bakterier) kan den hämmande koncentrationen indirekt skattas, förutsatt att testbetingelserna är exakt som för standardkurvan. Diffusionsmetoder är indirekta eftersom man är beroende av standardkurvor i tolkningen. För information om metodik och kvalitetssäkring se EUCAST:s webbplats.
Kvalitetssäkring nödvändig
Oavsett metod måste beprövade riktlinjer följas, och kvalitetskontrollen måste vara rigorös. Detta för att resultaten av en antibiotikakänslighetsbestämning ska bli reproducerbara och tillförlitliga. En felaktigt utförd resistensbestämning kan ge direkt missledande resultat, och kan då vara sämre än ingen undersökning alls. Det är till exempel av stor vikt att utgå från en renkultur för att få ett rättvisande svar. Vidare påverkas resultatet i hög grad av faktorer som bakterietäthet, temperatur och odlingsmedium. Intern kvalitetskontroll består bland annat av noggrann dokumentation av hela undersökningsgången, spårbarhet samt löpande kontroll av metodens prestanda genom att referensstammar regelbundet undersöks.
För godkända MIC-intervall för kontrollstammar se EUCAST:s quality control tables (pdf). Laboratorier som likt SVA är ackrediterade för resistensbestämning deltar i jämförelser med andra laboratorier och inspekteras årligen av oberoende experter.
Antibiotikaresistenstest med mikrodilutionsmetod
Instruktionsfilm om antibiotikaresistenstest med mikrodilutionsmetod. Testerna sätts från förkultur. Även räkning av inokulatets täthet demonstreras.