Du använder en gammal version av Internet Explorer eller Edge. För en bättre upplevelse rekommenderar vi att du istället använder den senaste versionen av Chrome, Firefox, Safari eller Edge.
På sva.se använder vi cookies/kakor för att webbplatsen ska fungera så bra som möjligt för dig och för att få statistik över hur våra webbsidor används. Om du inte vill ta emot kakor kan du ställa in din webbläsare att inte acceptera dessa. Läs om kakor på webbplatsen
Förkortningen PCR står för Polymerase Chain Reaction (polymeraskedjereaktion) och är en molekylärbiologisk metod som bland annat används för att söka efter sjukdomsalstrande smittämnen i provmaterial. Två av metodens styrkor är dess snabbhet och förmågan att detektera mycket små mängder av smittämnet i fråga.
Analysprincip
Med PCR-metoden spårar man ett smittämnes arvsmassa (deoxiribonukleinsyra, DNA eller ribonukleinsyra, RNA) genom att korta startsekvenser av DNA (på engelska "primers"), blandas med provet tillsammans med bland annat enzymet DNA-polymeras och nukleotider (DNA-byggstenar). Om smittämnets arvsmassa består av RNA föregås PCR-reaktionen av ett enzymatiskt steg som översätter RNA till DNA. Om smittämnet finns i provet kommer primrar att fästa vid två specifika punkter på smittämnets arvsmassa. Primrarna fungerar sedan som startpunkter för DNA-polymeraset som kopierar den mellanliggande DNA-strängen i en temperaturberoende process. Med hjälp av temperaturstyrningen upprepas sedan proceduren till dess en tillräckligt stor mängd kopior har skapats för att de ska kunna visualiseras med hjälp av fluorescens.
Det finns olika typer av PCR-tekniker. Den teknik som är vanligast vid diagnostiska laboratorier är probbaserad realtids-PCR där en fluorescerande prob binder in till den kopierade DNA-sekvensen. Fluorescensen detekteras sedan kontinuerligt under PCR-reaktionen
Tack vare "kopieringen" kan PCR-metoden användas för att spåra mycket små mängder av smittämne i ett prov.
När man får ett positivt resultat i en PCR-analys visar det att man påvisat det sjukdomsalstrande smittämnets arvsmassa i provet, till skillnad från odling som påvisar levande virus/bakterier, eller antikropps-ELISA som påvisar kroppens immunsvar mot ett visst smittämne.
Förutsättningen för en PCR-analys är en bestämd frågeställning, det vill säga man måste veta vad man letar efter, eftersom primrar och prober konstruerats för att hitta ett bestämt smittämne.
Frågor och svar
CT står för Cycle Treshold vilket är antalet temperaturcykler som har passerat innan fluorescensenivån för ett positivt prov passerar dess bakgrundsfluorescens. CT -värdet kommer därmed vara beroende av ursprunglig koncentration av mål-DNA. Generellt sett ger höga koncentrationer av ursprungligt mål-DNA ett lägre CT-värde och låga koncentrationer ett högre CT -värde. CT -värdet påverkas dock av många andra faktorer än bara ursprungskoncentrationen av mål-DNA, t.ex. PCR-reaktionens effektivitet, nivå på bakgrundsfluorescensen, förekomst av hämmande ämnen i provet.
I en kvantitativ PCR används CT -värdet för att uppskatta den initiala mängden av mål-DNA som fanns i provet genom jämförelse med en standardkurva som genereras från kända koncentrationer av mål-DNA.
CT-värde används för att sätta en gräns för om provet är positivt eller inte. Gränsvärdet för en specifik PCR-analys bestäms genom utvärdering, validering och verifiering av PCR-analysen. Hänsyn tas också till det diagnostiska syftet. Det är en balansgång mellan att ha tillräcklig känslighet för att upptäcka mål-DNA i infektionen och att undvika att få falskt positiva resultat, t .ex. kan vissa PCR-analyser reagera med icke-specifikt DNA och ge falskt positiva resultat om gränsvärdet är satt för högt. Om gränsvärdet sätts för lågt riskerar man istället att missa positiva prover (falskt negativa). Gränsvärdena för PCR-analysen påverkas av flera faktorer, inklusive primrarnas specificitet, vilka reagenser som används samt provernas beskaffenhet.
Felkällor vid PCR-analys kan uppstå genom kontaminering av provet, bristande validering av metoden, bristande provhantering och transport m.m..
För att minimera dessa risker används sterila tekniker, ren utrustning och kontroller. Det är viktigt att ha erfarenhet och förståelse för analysen av PCR-resultat för att undvika felaktig tolkning. Man måste vara medveten om potentiella felkällor och vidta åtgärder för att minska risken för falska PCR-resultat. Några exempel:
Om mängden virus eller bakterier är mycket låg, kan PCR-testet misslyckas med att påvisa mål-DNA. Detta kan hända om provet togs när infektionen var i ett tidigt eller sent skede, om provtagningen inte var tillräckligt noggrann eller om PCR-analysens känslighet inte är tillräckligt hög.
Om provet är förorenat eller degraderat kan det påverka PCR-resultatet. Föroreningar från andra ämnen eller bristande provhantering kan hindra PCR-reaktionen från att fungera korrekt.
Om primrarna, de korta DNA-sekvenser som används för att binda till mål-DNA och initiera PCR-reaktionen, är bristfälligt designade eller inte tillräckligt specifika, kan de misslyckas med att binda till mål-DNA korrekt. Det kan leda till att de inte lyckas kopiera mål-DNA:t fast det är där (falskt negativt resultat), eller att de korsreagerar med sekvenser som liknar mål-DNA:t men inte är identiska (falskt positivt resultat).
Om det finns hämmande substanser i provet, till följd av var eller hur provet togs eller hur det har lagrats, kan dessa hämma PCR-reaktionen och ge ett falskt negativt resultat.
Om mål-DNA har genetiska variationer eller mutationer som påverkar primrarnas bindning, kan detta leda till att PCR inte fungerar korrekt.
Tekniska fel i laboratoriet, som felaktig temperaturkontroll, kontaminering av reagenser eller utrustning, felaktigt hanterade prover och kontroller, mätfel eller kalibreringsfel, kan också resultera i falskt negativa eller falskt positiva resultat.
För att provresultaten ska vara tillförlitliga är det viktigt att det blir rätt hela vägen från provtagning, via transport och analys till provsvar.
För att minimera risken för falska resultat tas en mängd steg. Allt från att metoden används på det sätt och inom det område som den är validerad för till hur laboratoriet är fysiskt byggt, med skilda rum med klädombyte för olika delar av processen. Provhantering sker dessutom med handskar och arbete sker i säkerhetsbänkar klass II (skyddar både provet och operatören). Vidare krävs att personalen som hanterar proverna har gedigen upplärning och är behörig för att utföra analysen till att olika kontroller används för att säkerställa tillförlitligheten i de olika delarna av metoden, allt från negativ och positiva till interna och externa (med flera). Utöver detta är det vanligt förekommande att diagnostiska laboratorier är ackrediterade (på djursidan gäller ISO 17025:2017) och står därmed under kontroll av en oberoende tredje part, Swedac. Därigenom ställs ytterligare krav kontroll av utrustning, temperatur och spårbarhet med mera, allt för att säkerställa kvaliteten på laboratoriets analyser och tillförlitligheten på provresultaten.